Sekwencjonowanie DNA - co to jest, metody, zastosowania
Sekwencjonowanie DNA to technika w biologii molekularnej i medycynie, umożliwiająca precyzyjne określenie kolejności zasad nukleotydowych w genomach organizmów. Dzięki niej można lepiej zrozumieć strukturę genetyczną, mechanizmy dziedziczenia chorób oraz rozwijać personalizowane podejścia terapeutyczne.
Sekwencjonowanie DNA - definicja
Sekwencjonowanie DNA to technika, stosowana w praktyce laboratoryjnej. Korzystając z nowoczesnego sprzętu i odpowiednich reagentów, ustalenie sekwencji krótkich fragmentów DNA jest obecnie procesem stosunkowo prostym. Natomiast sekwencjonowanie całych genomów, obejmujących wszystkie chromosomy organizmu, jest zadaniem znacznie bardziej złożonym.
Sekwencjonowanie DNA to technika laboratoryjna, umożliwiająca ustalenie sekwencji zasad nukleotydowych adeniny (A), tyminy (T), cytozyny (C) i guaniny (G) w danym fragmencie DNA.
Definicja sekwencjonowania DNA
Proces sekwencjonowania całego genomu wymaga najpierw podzielenia długich nici DNA na mniejsze, zarządzalne segmenty. Następnie każdy z tych fragmentów jest sekwencjonowany osobno. Ostatecznym celem jest złożenie poszczególnych sekwencji w jedną, spójną sekwencję konsensusową, która odzwierciedla cały genom.
Rozwój technologii sekwencjonowania na przestrzeni ostatnich dwóch dekad znacząco przyspieszył i obniżył koszty tych analiz. Współczesne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), umożliwiają szybkie i efektywne odczytywanie dużych ilości DNA.
Cele sekwencjonowania DNA
Sekwencjonowanie DNA jest cennym narzędziem w wielu dziedzinach nauki i medycyny, ponieważ służy do różnorodnych celów badawczych oraz aplikacyjnych, takich jak:
- Badania podstawowe – poznanie struktury genomów różnych organizmów pozwala na zrozumienie ich ewolucji, funkcji genów oraz mechanizmów genetycznych, takich jak mutacje i polimorfizmy. Badania te są podstawą dla biologii molekularnej, genetyki i innych dziedzin nauki.
- Diagnostyka medyczna – sekwencjonowanie DNA jest używane do diagnozowania chorób genetycznych i rzadkich chorób dziedzicznych. Identyfikacja specyficznych mutacji genowych lub analiza całego genomu pomaga w ustaleniu przyczyn chorób u pacjentów oraz wspiera podejmowanie decyzji terapeutycznych.
- Medycyna personalizowana – dzięki sekwencjonowaniu DNA możliwe jest dostosowanie terapii do indywidualnych potrzeb pacjentów. Analiza wariantów genetycznych pozwala na predykcję odpowiedzi na leki, ocenę ryzyka chorób oraz zapobieganie chorobom dziedzicznym.
- Badania populacyjne – analizy genomów dużych populacji mogą dostarczać informacji o różnicach genetycznych między populacjami, predysponowanych do chorób genetycznych oraz o ich ewolucji.
- Rolnictwo i hodowla – sekwencjonowanie DNA jest wykorzystywane w hodowli roślin i zwierząt do selekcji genotypów odpornych na choroby, zwiększenia plonów lub poprawy cech genetycznych zwierząt gospodarskich.
- Ochrona środowiska – analiza genomów mikroorganizmów pozwala na monitorowanie i zrozumienie zmian w różnorodności biologicznej oraz roli mikroorganizmów w ekosystemach.
- Kryminalistyka – sekwencjonowanie DNA jest używane do identyfikacji jednostek oraz analizy śladów biologicznych pozostawionych na miejscu przestępstwa.
Sekwencjonowanie DNA a diagnostyka genetyczna
Sekwencjonowanie DNA jest również bardzo ważne w diagnostyce genetycznej, ponieważ umożliwia dokładną analizę materiału genetycznego pacjenta w celu identyfikacji mutacji genowych i innych zmian w sekwencji DNA, które mogą być związane z chorobami, dzięki czemu lekarze mogą przeprowadzić:
- Analizę chorób genetycznych – sekwencjonowanie DNA jest używane do identyfikacji specyficznych mutacji genowych lub wariantów genetycznych, które są związane z różnymi chorobami dziedzicznymi. Dzięki temu możliwe jest postawienie precyzyjnej diagnozy genetycznej u pacjentów z nieznana wcześniej przyczyną chorób.
- Personalizację terapii – znalezienie specyficznych mutacji genetycznych pozwala na dostosowanie terapii do indywidualnych potrzeb pacjentów. To może obejmować dobranie leków, unikanie leków, które mogą nie być skuteczne lub mogą powodować działania niepożądane, oraz ocenę ryzyka rozwoju chorób.
- Rozpoznanie ryzyka dziedziczenia – sekwencjonowanie DNA pozwala na ocenę ryzyka dziedziczenia chorób genetycznych. Jest to szczególnie istotne w przypadku pacjentów planujących rodzinę lub mających historię rodową chorób genetycznych.
- Screening populacyjny – analizy genomów dużych populacji mogą dostarczać informacji na temat częstości występowania określonych mutacji genetycznych oraz predyspozycji do chorób genetycznych w różnych grupach populacyjnych.
- Badania prognostyczne – sekwencjonowanie DNA może również służyć do badania prognostycznego, co oznacza analizowanie genetycznych predyspozycji do rozwoju chorób w przyszłości.
Pierwsze techniki sekwencjonowania DNA
Pierwsze techniki sekwencjonowania DNA, rozwijane od lat 70. XX wieku, stanowiły przełom w badaniach genetycznych, umożliwiając analizę i zrozumienie struktury genetycznej organizmów. Trzy kluczowe techniki, które otworzyły drogę do dzisiejszych zaawansowanych metod sekwencjonowania, to metoda degradacji chemicznej, metoda terminacji łańcucha (Sanger sequencing) oraz metoda sekwencjonowania Maxama-Gilberta.
Metoda degradacji chemicznej
Pierwsza z wymienionych, czyli metoda degradacji chemicznej, została opracowana na początku lat 70. przez Fredericka Sangera i Alaana Coulsona. Polegała na degradacji fragmentów DNA w obecności chemicznych czynników degradacyjnych, takich jak kwas fenyloboronowy. Następnie, za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, analizowano różnice w migracji fragmentów DNA, co pozwalało na określenie ich sekwencji.
Sekwencjonowanie Sangera
Kolejnym etapem było opracowanie metody terminacji łańcucha, znanej również jako sekwencjonowanie Sangera. Fred Sanger i jego zespół zaproponowali tę metodę w 1977 roku. Opiera się ona na sekwencyjnym dodawaniu zmodyfikowanych dideoksynukleotydów do reakcji polimeryzacji DNA. Dideoksynukleotydy nie mają grupy hydroksylowej na 3' końcu, co powoduje zakończenie dalszej syntezy nici DNA w danym miejscu. Po elektroforezie i analizie uzyskanych fragmentów DNA można odtworzyć sekwencję pierwotnego DNA.
Sekwencjonowanie Maxama-Gilberta
Trzecią kluczową techniką było sekwencjonowanie Maxama-Gilberta, które również pojawiło się w latach 70. Metoda ta angażuje chemikalia, takie jak dimetylosulfonian, do modyfikacji zasad nukleotydowych w DNA, co prowadzi do zatrzymania reakcji syntezy w tych punktach. Po kolejnych etapach rekombinacji i elektroforezy możliwe jest odtworzenie sekwencji DNA.
Sekwencjonowanie DNA nowej generacji
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to grupa zaawansowanych technologii, które zrewolucjonizowały dziedzinę biologii molekularnej poprzez umożliwienie szybkiego, taniego i masowego sekwencjonowania DNA. Nazwa "nowa generacja" odzwierciedla postęp w stosunku do starszych metod, takich jak sekwencjonowanie Sangera.
NGS wykorzystuje wiele innowacyjnych technik, które różnią się od tradycyjnego sekwencjonowania Sangera. Kluczowe cechy NGS to wysoka równoległość, mikroskala, szybkość oraz niższe koszty. Procesy sekwencjonowania są prowadzone równocześnie dla wielu próbek na chipie lub w innej mikroskalowej platformie, co znacznie przyspiesza czas uzyskania wyników w porównaniu do metod sekwencjonowania Sangera.
W 2001 roku sekwencjonowanie całego ludzkiego genomu za pomocą metody Sangera kosztowało około 100 milionów dolarów. Dzięki NGS już w 2015 roku można było to zrobić za zaledwie kilkanaście tysięcy dolarów, co ilustruje drastyczny spadek kosztów w krótkim czasie.
Istotność szybkiego i taniego sekwencjonowania jest ogromna, szczególnie w kontekście rozwoju personalizowanej medycyny. Zdolność do rutynowego sekwencjonowania genomów pozwala na identyfikację indywidualnych wariantów genetycznych, co może mieć kluczowe znaczenie w diagnozowaniu chorób, dostosowywaniu terapii oraz przewidywaniu odpowiedzi pacjentów na leczenie. Dodatkowo, NGS umożliwia prowadzenie szeroko zakrojonych badań biologicznych, badania populacyjne, oraz analizy genomów bakterii i innych mikroorganizmów, co ma zastosowanie w dziedzinie nauk biomedycznych i ochrony zdrowia publicznego.
- F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 74 (12), 1977, s. 5463–5467.
- A.M. Maxam, W. Gilbert, A new method for sequencing DNA, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 74 (2), 1977, s. 560–564.
- J. Soh, P. Gordon, C. Sensen: Genome Annotation. Chapman & Hall/CRC, 2013.